果蠅(Drosophila Melanogaster),在生醫領域是個超級巨星。憑著牠強大的基因工程工具,能操縱某個器官的基因,使科學家得以相較於用哺乳類動物作為實驗對象,更快的去解答他們心中疑惑,或是驗證某個理論。在腦神經科學中,果蠅甚至是研究睡眠的工具之一。

甚麼!人類的睡眠能跟這蟲比嗎?就算從果蠅的小腦袋的研究中獲得甚麼好了,真的能對瞭解我們高級靈長類的睡眠認識有幫助嗎?

即使果蠅與人的睡眠有著許多不同,比如說我們並不會把果蠅的睡眠行為二分為快速動眼期 (REM sleep)和非快速動眼期(NREM sleep),但現在也科學家普遍認知到,許多非常重要的生物機制,在演化上因為太根本太重要了所以會有一定程度的保留;也就是說果蠅的睡眠行為 (睡覺可是攸關存亡的大事),其實跟我們也有很多類似的地方: (Shaw, Paul J., et al.)

  1. 與許多哺類動物相同,有靜止的活動(quiescence)與固定的睡眠姿勢(stereotyped posture)[圖1]
  2. 一樣在睡眠狀態時較不容易醒(an elevated arousal threshold)
  3. 在有外力介入時,果蠅的睡眠也具有快速轉換為清醒狀態的能力(rapid reversibility)
  4. 果蠅也會補眠喔!他們也具有睡眠恆定的機制,當睡眠被剝奪時會有補眠的行為(a homeostatic response to sleep deprivation)
  5. 果蠅的睡眠—清醒週期也有受生理時鐘的介入調控
  6. 雖然不像哺乳類動物有著EEG腦波活動所定義的不同的睡眠階段,當科學家把電極伸入牠們的小腦袋時,發現有著不同的電場活動 (van Alphen  et al., 2013) 隨著睡眠時間變化,暗示著果蠅其實也可能有不同深度的睡眠階段喔!
圖1. 果蠅的睡眠姿勢(sleep posture)。透過攝影機的紀錄,科學家現在已經確認果蠅正如其他動物一樣,有著特定的睡眠姿勢。從左圖可以察覺在睡眠階段時的身體的放鬆狀態(頭部與翅膀呈放鬆狀)。右圖則是隨時間變化(右上角)的姿勢變化。可以清楚的看到在14分鐘內(3:28 – 3:42), 果蠅身體姿勢進入睡眠後的變化。左圖取自; 右圖取自

因為這些本質上的相似,並具備強大的基因工程工具供研究者使用,從2000年開始,我們對於認識睡眠的許多突破都是來自果蠅研究呢!別忘了,關於生理時鐘的運作機制,也是先從果蠅的研究上有所突破,再從實驗鼠的研究中驗證、延伸喔!(延伸閱讀可參考此連結

我們要怎麼研究果蠅的睡眠呢?

其實,即使是哺乳類的睡眠研究,除了在腦袋中放入電極偵測腦波活動,另一種方法是直接以動物們的活動與不活動作為快速的睡眠行為偵測。以我們實驗室的實驗為例,我們會把電腦連接攝影機紀錄老鼠的行為;當老鼠的大部分身體(95%)都處於不動超過一定的時間後,電腦的軟體就會判斷這隻老鼠已經進入睡眠狀態[圖 2]。這種透過靜止狀態來判斷睡眠行為 (immobility-defined sleep)的準確度通常都是大於95% (Fisher et al. 2012)。

果蠅的睡眠研究其實也是利用類似的概念:很多實驗室會用紅外線偵測裝置,偵測實驗果蠅是處於活動狀態或是靜止狀態,若是靜止超過5分鐘以上,就會判斷這隻果蠅是處於睡眠狀態。這種透過靜止狀態來判斷睡眠行為的研究方法的優點是(包括實驗鼠或是果蠅),不需要進行麻煩的電極插入手術;但對於實驗鼠而言,無法得知更精準的腦波活動狀態是其缺點。

圖2. 透過靜止狀態來判斷睡眠行為(immobility-defined sleep)。除了紀錄EEG腦波活動的睡眠之外,透過靜止狀態來偵測睡眠行為,提供了科學家快速簡單的方法紀錄實驗對象的睡眠活動。圖A. 為我們實驗室的睡面紀錄的電腦螢幕截圖。透過軟體的幫助,電腦能夠自動判斷該老鼠處於清醒 (左) 或是睡眠 (右) 的狀態,並記錄睡眠時間的長短。圖B. 為常見的果蠅活動偵測系統。果蠅的活動會打斷紅外線光束,於是電腦能透偵測實驗果蠅在一個時間單位內的活動量大小。圖片修改於

大部分的實驗室所使用的果蠅品種都是日行性的, 也就說白天活動晚上睡覺[圖. 3A]。而控制果蠅的大腦中有兩個睡眠中心:中央綜合體(central complex, 簡稱CX)蕈形體(mushroom bodies, 簡稱MB )。蕈?果蠅腦袋中長香菇?阿…不是…只是許多節肢動物(包括果蠅)大腦中有個神經纖維網, 對於記憶與睡眠扮演重要的腳色,它的樣子長得太像蕈類了[圖. 3B]所以得此名。CX和MB 都可以再更細分為個別的小結構,但這繁瑣的細節就還是讓研究生們操心煩惱,大家記得CX 和MB是果蠅的睡眠控制中心就好。

圖3. 果蠅的睡眠清醒周期與蕈形體。(A) 果蠅在12小時光亮-12小時黑暗的光周期環境下的睡眠時數變化。可以清楚看到果蠅在晚上睡眠時數是白天約10被左右。圖下方的黑色長條圖表示12小時的黑暗環境。(B) 如果我們可以透視果蠅的小腦袋,可以看到兩個重要的睡眠中心:CX (圖正中央黃色/橘色結構) 與 MB (藍色)。MB 因為結構的樣子與太像蕈類了,於是得到了這個非常好記的稱呼 (mushroom body)。圖A改自於;圖B的果蠅頭部卡通圖改自於,下方的綠色MB放大圖取自於

首先來看看研究員怎麼利用果蠅的基因工程工具來研究睡眠好了。背扇形體(dorsal fan-shaped body,簡稱dFB)是CX 的集合結構中的一員,Jeffery Donlea 和其研究團隊發現,如果去突變dFB的其中一個基因,實驗果蠅的睡眠時數便有著顯著性的下降。除此之外,突變果蠅的睡眠恆定調解也會出現問題:如果限制突變的果蠅和其控制組都不睡覺12小時,就觀察到突變果蠅竟然沒有去補償這被剝奪的睡眠時數;也就是說,突變果蠅沒有補眠行為[圖.4]

圖 4. 受影響的睡眠恆定調節。研究團隊發現,突變果蠅即使被剝奪睡眠12小時(圖中灰色陰影),卻沒有補眠的行為。Y軸是失去睡眠的百分比,以睡眠剝奪結束時所損失的睡眠時數為100,並測量後續的補眠行為能彌補多少失去的睡眠。實驗結果顯示,控制組會增加白天的午休時數,並在第二個晚上時恢復約一半的失去睡眠時數;相反的,突變果蠅並沒有顯著的補眠行為,即使到了第二個晚上,大約只恢復了20%的失去睡眠時數。圖改自

為什麼沒補眠?兩種可能的解釋

  1. 突變果蠅根本不需要補眠:就像有些人天生只需要睡4小時,有可能突變使得果蠅對於睡眠時數的需求減少了
  2. 突變果蠅其實需要補眠,但沒有辦法補眠。也就是說,熬夜了12小時候明明累得半死,但就是睡不著

為了釐清這兩個可能性,研究團隊測試了突變果蠅的學習與記能力。測試的假說是這樣:因為睡眠對學習與記憶能力的影響,在人類、實驗鼠與果蠅等多物種上反覆驗證,所以如果突變果蠅只是對於睡眠時數的需求減少了那其學習與記憶能力就不會受到睡眠剝奪的影響;相反的,如果突變果蠅是有補眠的需求卻沒有辦法補眠,那其學習與記憶能力就會受到睡眠剝奪的影響而下降

實驗結果觀察到,有著充足睡眠的控制組果蠅,在學習與記憶的測試上有著60%的正確率;但當睡眠被剝奪時,正確率下滑至20%。而突變果蠅的表現能力,與睡眠被剝奪的控制組一樣糟。這樣的結果顯示:突變果蠅並不是對於睡眠時數的需求減少,而是控制睡眠的恆定機制因為基因突變的操作而受到了影響。

對於所有突變的實驗而言,還有個重要的問題是永遠需要考慮:因為基因突變是打從胚胎時期就存在的差異,所以我們得到結果是來自於胚胎發育(developmental effect)影響呢?還是真的來自於基因本身(genotypic effect)影響呢? 為了避開這個變數,我們需要一個即時性的工具,可以在實驗體已經長大成熟後,再去操弄其基因表現,這樣就能避開胚胎發育的影響。

操弄果蠅基因,找出睡眠關鍵

對於果蠅實驗而言,科學家DNA的層級中,放入一個溫度感應器,透過溫度的變化抑制或活化特定的基因。也就是說,果蠅從幼蟲長成成熟體的過程中,會處在同一個溫度環境中,當有實驗需求時再去改變其居住環境的溫度,達到即時影響基因表現的目的,並避開胚胎發育時操弄基因的影響。

該研究團隊將這個溫度感應器(GAL80ts),與基因抑制的工具(RNAi)結合,只有當果蠅處於比較高溫的時候,這個基因溫度感測器才會被活化,啟動基因抑制的工具(RNAi),並且去抑制前述被突變的基因。而他們發現,帶著溫度感應器的突變果蠅,其睡眠時數在溫度21度時與控制組無異,一旦溫度上升至31度時,睡眠時數下降了15-20%!證實了這個基因對於睡眠的重要性。而現在我們知道這個基因(ExFl2)與控制神經細胞的離子通道有關,因此能夠改變dFB的神經活動,進而影響其睡眠行為。

利用這個溫度感應器,搭配果蠅的遺傳工具資料庫,科學家能快速透過交配不同基因組成的果蠅,得到能夠操縱目標基因的下一代果蠅來做實驗。比如說,Johns Hopkins大學的研究人員以此發現了果蠅的睡眠驅動力(sleep drive),可能紀錄在特定神經細胞活動上 (Liu et al. 2014)

睡眠驅動力是甚麼呢?還記得熬夜趕工整晚沒睡,若隔天早上沒有機會打個盹,下午就會有股擋都擋不住的睡意嗎?那股大腦逼著你去睡覺的壓力就是睡眠驅動力。研究團隊先發現,當他們透過溫度感應器活化特定基因時,即使溫度回復到室溫,實驗果蠅還是會很想睡覺[圖 5A],暗示著這個基因的活化能夠增加睡眠驅動力。

相反的,如果故意讓神經細胞表現神經毒素而破壞它們的話,實驗的果蠅即使睡眠被剝奪,也不會出現如控制組的補眠行為[圖 5B];這進一步證實神經元對於睡眠驅動力而言很重要。研究團隊後來發現,這個基因是表現在CX的其中一個組成結構中(ellipsoid body),而這些神經元的活動/興奮程度,會隨果蠅保持清醒時間的長短而增強或減弱[圖5C]。這為大腦如何知道我們清醒了多久,是否該去睡覺休息提供了神經迴路層級上的發現,讓我們對於大腦如何控制睡眠又有進一步的認識。

圖5. 果蠅的睡眠驅動力機制實驗。(A) 透過文章中所述的溫度感應器,研究團隊透過提高居住環境(途中黃色區塊, 29度), 能夠直接啟動果蠅大腦中的特定基因。有些基因與清醒有關,一旦被開啟就會抑制睡眠行為;但是這個效果一旦回復到22度就消失了(最上圖)。有些基因與睡眠有關,被開啟就會促進睡眠行為;但是這個效果一旦回復到22度就消失了(中間圖)。另外,也有基因不僅促進睡眠行為,而且這個效果即使居住環境回復到22度,睡眠行為依舊維持著(最下圖)。黑色線為野生型(wild type, WT)控制組,其他顏色的線則為實驗組 (B) 當進行睡眠剝奪後,控制組(上圖)有著立即的補眠行為(黑色線),可以看到控制組果蠅的白天睡覺時間,比沒有睡眠剝奪(淺灰色線)的時候更多。但當移除圖A中能夠持續影響睡眠行為基因(R69F08)的神經細胞群時(實驗組), 實驗果蠅在白天的睡眠時數(粉紅色線),與沒有睡眠剝奪的睡眠(baseline)時數相似,暗示著補眠行為的下降。(C) 進一步直接偵測圖A中能夠持續影響睡眠行為基因(R69F08)的神經細胞群時,研究團隊發現其活動/興奮程度會隨果蠅保持清醒時間的增長而增強。

果蠅腦袋一小步,人類睡眠一大步

人為什麼要睡覺?我們如何睡覺?即使到了現在,仍是正在研究的題目,還有太多的疑點我們還不清楚。雖然果蠅與我們有不同之處,但在睡眠的機制上也與我們有著許多驚人的類似處。憑藉著已經建立起來的強大的基因工程工具(如前述的溫度感應器),我們能夠一步一步的解析大腦的神經迴路之間是如何溝通的,並期待有一天我們能把每一塊拼圖都拚上,徹底了解睡眠是如何在我們大腦中運作,並將這些知識應用在醫療上,造福許多因為疾病而不再能輕易入睡的人們。

參考文獻

  1. Donlea, Jeffrey M., Diogo Pimentel, and Gero Miesenböck. “Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila.” Neuron 81.4 (2014): 860-872.
  2. Hendricks, Joan C., et al. “Rest in Drosophila is a sleep-like state.” Neuron 25.1 (2000): 129-138.
  3. Hendricks, Joan C., Amita Sehgal, and Allan I. Pack. “The need for a simple animal model to understand sleep.” Progress in neurobiology 61.4 (2000): 339-351.
  4. Kayser, Matthew S., and David Biron. “Sleep and development in genetically tractable model organisms.” Genetics 203.1 (2016): 21-33.
  5. Liu, Sha, et al. “Sleep drive is encoded by neural plastic changes in a dedicated circuit.” Cell 165.6 (2016): 1347-1360.
  6. Shaw, Paul J., et al. “Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.” Science 287.5459 (2000): 1834-1837.

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